emfret成立于(yu)2002年，emfret公司專注心血管和血液系統研究用抗體研發和生產，emfret公(gong)司的(de)抗體不僅適用于

流式分析、WB檢測，還可用(yong)于免疫(yi)組化/免疫熒(ying)光及免疫共(gong)沉淀檢測。

產(chan)品列表

抗體相(xiang)關實驗技術Protocols

一(yi)、小鼠血小板表面糖蛋(dan)白(bai)的(de)流式細胞術分析(xi)

緩沖液和試劑準備：

Tris緩(huan)沖鹽水/肝素（TBS/Hep）：20mM Tris/HCl；137mM NaCl；pH 7.3；含有20U/ml肝(gan)素。

磷酸鹽緩沖液（PBS）：137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH₂PO₄；8mM Na₂HPO₄；pH 7.14。

改良臺氏液(ye)/改良Tyrode''s溶液：134mM NaCl；0.34mM Na₂HPO₄；2.9mM KCl；12mM NaHCO₃；20mM Hepes；pH 7.0；5mM葡萄糖；0.35%（w/v）牛血清白(bai)蛋白(bai)。

腺苷三磷(lin)酸雙磷(lin)酶Apyrase：溶于水（10 U/mL），在-20°C下儲存(cun)。

前列環素(su)Prostaglandin（Prostaglandin 2, PGI2）：溶(rong)于水(shui)（1 mM），在-20°C下儲存。

CaCl₂：1 M溶于水。

稀(xi)釋或洗(xi)滌全血的制備：

1、用肝素化玻璃毛細管（如環帽）從眶后神經叢抽(chou)取50µL血液，放(fang)入1.5 ml含有200µLTris緩(huan)沖鹽水/肝素（20 U/ml）的試(shi)管中。

2、在1 mL Tyrode緩沖液中稀釋，用于流(liu)式細胞儀分析(xi)。

3、為了制備洗滌過的血液(ye)，將稀(xi)釋的血液(ye)以(yi)900 x g離心5分鐘(zhong)，去除(chu)上清液，并將沉(chen)淀重懸(xuan)在1.25 mL Tyrode緩沖液中。

4、在實驗開始前直接加入1mM CaCl₂。

注：對(dui)于凝(ning)血酶誘導的血小板活(huo)化，必須(xu)去(qu)除血漿以防止抗(kang)凝(ning)血酶活(huo)性。

血(xue)小板制備(bei)：

1、制備(bei)洗滌過的(de)血(xue)小(xiao)(xiao)板是一(yi)種更耗(hao)時的(de)方法，需要大量的(de)血(xue)液，但產(chan)生的(de)血(xue)小(xiao)(xiao)板制劑可以使用數小(xiao)(xiao)時。

2、用1.5 cm玻璃毛細管從眶(kuang)后叢收(shou)集(ji)0.5-1 mL血液，放入含有200 µL TBS/肝素（20 U/ml）的1.5 mL管中(zhong)。去除含有一些紅細胞(bao)的(de)上清(qing)。

3、以500 x g離(li)心樣品5分鐘(zhong)，并將富含血小板的血漿（PRP）轉(zhuan)移到新的試管(guan)中。

4、將血小(xiao)板懸浮液以300 x g離心8分鐘，并將不含任何紅(hong)細胞的PRP轉移到(dao)新的(de)試管中。

5、加入0.5 µM前(qian)列環素(su)（PGI2），以1300 x g離心5分鐘(zhong)。

6、將(jiang)血小(xiao)板顆粒重新懸浮在1 mL Tyrode緩沖液中，加入0.02 U/mL腺苷三磷(lin)酸雙磷(lin)酶和0.5 µM前列環素(su)，在37℃下孵(fu)育5分鐘，并在1300 x g下離心(xin)5分鐘(zhong)。

7、重(zhong)復步驟5，將血(xue)小板顆(ke)粒重(zhong)懸于0.5 ml Tyrode緩沖液中，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸雙(shuang)磷酶，并在(zai)37℃下(xia)孵育30分鐘。

血小板表面糖蛋白的(de)單(dan)色分(fen)析(xi)：

1、將5 µL特異性或陰性對照抗(kang)體和(he)25 µL稀釋的(de)全血在分析管中混(hun)合，渦(wo)旋混(hun)勻(yun)1-2秒(miao)。

2、在室溫下孵育15分鐘(zhong)。

3、加入400 µL PBS停(ting)止反應，并在30分(fen)鐘內進行分(fen)析。

如(ru)所述，將樣品與FITC綴合的對照IgG（黑線）、GPVI抗體(ti)或GPV抗體孵(fu)育。血小板(ban)通過前向散射（FSC）/側(ce)散(san)射（SSC）血小板通過前向（FSC）/側向（SSC）散射特征進行篩選(xuan)。在單獨的直方圖中(zhong)顯示了被篩選(xuan)（R1）的血小(xiao)板(ban)的熒光(guang)（FL1）強度。RBC：紅細胞。

血(xue)小板(ban)活化(hua)的(de)雙色分(fen)析：

1、將5 µL特異性或陰性對照(zhao)抗(kang)體與5 µL泛血小板(ban)標記物一起加(jia)入測(ce)定(ding)管中。

2、此時，加入小體積(ji)（<5 µL）的任何額外的試劑（如抑制劑）。

3、加入26 µL稀(xi)釋(shi)的(de)全(quan)血或經洗滌(di)過的(de)血小板（100萬），渦旋(xuan)混勻1-2秒。

在(zai)室溫(wen)下孵育15分鐘(zhong)。加入400 µL PBS停止反應(ying)，并在30分鐘內進行分析。

小鼠(shu)血小板分別與(yu)PBS或0.1U/mL的(de)凝血酶（thrombin）一(yi)起與FITC和PE結合(he)的(de)mAbs一(yi)起孵育。通過GPIX或GPIIbIIIa（FL1; gate 1）的(de)表達對血小板進行(xing)了(le)篩選。

二、免疫組織(zhi)化(hua)學（用(yong)丙酮固定冷凍切片(pian)）

請注意：不建議在（對）甲醛固定(ding)的樣本上(shang)進行(xing)免疫組織化學染色，因為大多數大鼠(shu)抗體在這些條件下(xia)對(dui)小鼠(shu)組(zu)織的(de)效果很差。

1、將(jiang)冷凍組織(zhi)的切片(pian)(pian)放在(zai)玻片(pian)(pian)上，并在(zai)4°C下(xia)的冰冷100%丙酮(tong)中固定20分(fen)鐘。在(zai)室溫下干(gan)燥一整夜(ye)。

2、為(wei)了(le)減少試劑(ji)的(de)用(yong)量，在(zai)玻片(pian)上的(de)組織切片(pian)周圍(wei)可以用(yong)防水筆(bi)畫一個疏(shu)水圈(quan)。在(zai)所有后續的(de)步驟中(zhong)，這個圈(quan)起來的(de)區域都不(bu)應該干燥。因(yin)此，建議在(zai)潮濕的(de)盒子中(zhong)進行孵育步驟。

3、在PBS中孵育玻片20分(fen)鐘。

4、使用過氧化物酶結合的二抗時，將(jiang)玻片在室溫下與0.03%的H₂O₂孵育10分鐘以(yi)抑制(zhi)內(nei)源過氧化物酶活性。在PBS中三(san)次(ci)洗滌(di)玻片，每次(ci)5分鐘。

5、用PBS稀釋（比例(li)1:10或1:100）的(de)封閉液（二抗(kang)體宿(su)主物(wu)種的血清），室溫下孵育(yu)玻片(pian)1小時。

6、一抗（2-10 µg/ml）室溫(wen)孵育2小時。

7、吸取多余液(ye)體，然后在PBS中洗滌三次，每次5分鐘。

8、用熒光(guang)素或過氧化物酶(mei)結合的二抗（例如：親和(he)純化的驢(lv)抗大鼠(shu)IgG-FITC或HRP）覆蓋玻片，按照說明書(shu)在(zai)封閉液中稀釋，室溫下孵育1小時。

9、吸取(qu)多余液體(ti)，PBS洗滌(di)三(san)次，每次5分鐘。

10、熒光染色的(de)樣本可以直接通(tong)過熒光顯微(wei)鏡分析(xi)。

11、為(wei)了可視(shi)化過氧化物酶標(biao)記的(de)組織，用新鮮制備的3-氨(an)基(ji)-9-乙基咔唑（AEC）底(di)物覆蓋玻片，并在顯微鏡下可(ke)見紅色染(ran)色，時(shi)間可(ke)在5至30分鐘(zhong)之間變化。在橙色背景染色出現之前，用(yong)去離子水沖洗停止反應(ying)。用(yong)伊紅染色(se)30-240秒，然后在溫水中(zhong)沖洗玻片20分鐘。使用水溶性封裝溶液固(gu)定(ding)切片。

三、免疫沉淀

緩沖液(ye)和試劑準備(bei)：

PBS/EDTA：137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、8.0mM Na₂HPO₄ x 2H₂O，pH 7.3；5 mM EDTA。

IP緩沖液：40 mM Tris/HCl、0.3 M NaCl、1 mM EDTA、2 mM PMSF、10µg/mL Leupeptin蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑、10µg/mL Aprotinin抑肽酶、1µg/mL Pepstatin胃蛋(dan)白酶(mei)抑制(zhi)劑。

Igepal非離子表面活性劑：10%的H₂O溶液(ye)。

2x SDS樣品緩(huan)沖液：10%β-巰基(ji)乙醇（用于還原緩沖液）、10%Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)（1.25 M）、20%甘油、4%SDS、0.02%溴酚藍。

1、將小(xiao)鼠(shu)血(xue)小(xiao)板(ban)或細(xi)胞在(zai)1 mL PBS/EDTA（5分鐘，1300 x g）中(zhong)洗滌3次，并(bing)使用(yong)IP緩沖液重懸(xuan)。

2、加(jia)入(ru)1%Igepal 在室溫下溶解(jie)血小板（15–20分鐘）。

3、10000 x g下離心5分鐘去除細(xi)胞碎片，并(bing)將上(shang)清液(ye)轉移到新的(de)試管中(zhong)。

4、加入20µL洗滌(di)過的protein G agarose（PGA）。在4°C下混勻孵育(yu)至少3小時。

5、3000 x g離心樣品5分鐘。將(jiang)上清液轉移到新(xin)的試(shi)管中，以說明書中給定的濃度（通常(chang)在2-5µg/mL之間）加入抗(kang)體(ti)，30分鐘后加入25µL洗滌過的PGA。在4°C下混勻孵育至少2小(xiao)時，最好過夜。

6、將樣品在3000 x g下離(li)心1分鐘，向PGA中加(jia)入1 mL含有1%Igepal的1 x IP緩沖液(ye)。在3000 x g下離心1分鐘。

7、用IP緩沖液中洗滌(di)PGA兩次（3000 x g離心1分(fen)鐘）。

8、加(jia)入25µL 1x SDS樣品緩沖液（還原(yuan)或(huo)非(fei)還原(yuan)），將(jiang)PGA重(zhong)懸，煮沸(fei)5分鐘。9、然后(hou)將(jiang)樣品冷凍（-20°C）以備日后使用(yong)，或者(zhe)進行SDS-PAGE和(he)免疫印(yin)跡分析。

四、免疫(yi)印(yin)跡分析（Western Blot Analysis）

緩沖液(ye)和試劑準備：

裂解緩(huan)沖液：40mM Tris/HCl、0.3M NaCl、1mM EDTA、0.05%NaN₃、1%Igepal。

PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH₂PO₄、8.0 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O，pH 7.3。

5%脫(tuo)脂牛奶(nai)-PBS：含5%脫脂奶粉的PBS。

PBS/T：PBS含0.1%吐溫20。

1%脫脂(zhi)牛奶-PBS/T：含1%脫脂(zhi)牛奶的PBS/T。

所有步驟(zou)都(dou)可在室溫(wen)下(xia)進行：

1、在裂解(jie)緩沖液中制備小鼠血小板或細(xi)胞的裂解(jie)物，并與（2x）SDS樣品緩沖(chong)液在95°C下孵(fu)育5分(fen)鐘。

2、根據說明書，在(zai)還原或非還原條(tiao)件(jian)下，通(tong)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(yong)（SDS-PAGE）分(fen)離(li)蛋(dan)白質，并將蛋(dan)白質轉(zhuan)移到PVDF膜上。

3、用5%脫脂牛奶封閉(bi)膜(mo)1小時。

4、加入PBS/T-1%牛奶稀釋的一抗（2-5µg/mL），孵育(yu)1小時。

5、用PBS/T沖洗膜兩次，30分鐘。洗滌程序可以減(jian)少(shao)到三次(ci)，每(mei)次(ci)10分(fen)鐘。

6、加入PBS/T-1%牛(niu)奶稀釋(shi)的二抗（HRP偶聯的抗大鼠Ig），孵育45-60分鐘。

7、用PBS/T沖洗膜兩次，30分鐘。

8、使用(yong)ECL（化學發光）顯色(se)。

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